工具顯微鏡的七種觀察方式

工具顯微鏡的明視野鏡檢是大家比較熟悉的一種鏡檢方式，廣泛應用于病理、檢驗，用于觀察被染色的切片，所有顯微鏡均能完成此功能。

明視野

二.工具顯微鏡暗視野觀察(Dark field DF)

蔡司顯微鏡暗視野實際是暗場照明發(fā)。它的特點和明視野不同，不直接觀察到照明的光線，而觀察到的是被檢物體反射或衍射的光線。因此，視場成為黑暗的背景，而被檢物體則呈現(xiàn)明亮的象。

暗視野的原理是根據(jù)光學上的丁道爾現(xiàn)象，微塵在強光直射通過的情況下，人眼不能觀察，這是因為強光繞射造成的。若把光線斜射它，由于光的反射，微粒似乎增大了體積，為人眼可見。

m..m 暗視野觀察所需要的特殊附件是暗視野聚光鏡。它的特點是不讓光束由下至上的通過被檢物體，而是將光線改變途徑，使其斜射向被檢物體，使照明光線不直接進入 物鏡，利用被檢物體表面反射或衍射光形成的明亮圖象。暗視野觀察的分辨率遠高于明視野觀察，最高達0.02—0.004

暗視野

三.工具顯微鏡的相差鏡檢法(Phase contrast PH)

蔡司顯微鏡在光學顯微鏡的發(fā)展過程中，相差鏡檢術的發(fā)明成功，是近代顯微鏡技術中的重要成就。我們知道，人眼只能區(qū)分光波的波長(顏色)和振幅(亮度)，對于無色通明的生物標本，當光線通過時，波長和振幅變化不大，在明場觀察時很難觀察到標本.

相差顯微鏡利用被檢物體的光程之差進行鏡檢，也就是有效地利用光的干涉現(xiàn)象，將人眼不可分辨的相位差變?yōu)榭煞直娴恼穹?，即使是無色透明的物質(zhì)也可成為清晰可見。這大大便利了活體細胞的觀察，因此相差鏡檢法廣泛應用于倒置顯微鏡。

相差圖片

相差顯微鏡的基本原理是，把透過標本的可見光的光程差變成振幅差，從而提高了各種結構間的對比度，使各種結構變得清晰可見。光線透過標本后發(fā)生折 射，偏離了原來的光路，同時被延遲了1/4λ(波長)，如果再增加或減少1/4λ，則光程差變?yōu)?/2λ，兩束光合軸后干涉加強，振幅增大或減下，提高反 差。在構造上，相差顯微鏡有不同于普通光學蔡司顯微鏡顯微鏡兩個特殊之處：

1. 環(huán)形光闌(annular diaphragm) 位于光源與聚光器之間，作用是使透過聚光器的光線形成空心光錐，焦聚到標本上。

2. 相位板(annular phaseplate)在物鏡中加了涂有氟化鎂的相位板，可將直射光或衍射光的相位推遲1/4λ。分為兩種：

1. A 相板：將直射光推遲1/4λ，兩組光波合軸后光波相加，振幅加大，標本結構比周圍介質(zhì)更加變亮，形成亮反差(或稱負反差)。

2. B 相板：將衍射光推遲1/4λ，兩組光線合軸后光波相減，振幅變小，形成暗反差(或稱正反差)，結構比周圍介質(zhì)更加變暗

工具顯微鏡的相差原理

四.工具顯微鏡的微分干涉稱鏡檢術(Differential interference contrast DIC)

微分干涉鏡檢術出現(xiàn)于60年代，它不僅能觀察無色透明的物體，而且圖象呈現(xiàn)出浮雕壯的立體感，并具有相襯鏡檢術所不能達到的某些優(yōu)點，觀察效果更為逼真。

工具顯微鏡的原理;

蔡司顯微鏡微分干涉稱鏡檢術是利用特制的渥拉斯頓棱鏡來分解光束。分裂出來的光束的振動方向相互垂直且強度相等，光束分別在距離很近的兩點上通過被檢物體，在相位上略有差別。由于兩光束的裂距極小，而不出現(xiàn)重影現(xiàn)象，使圖象呈現(xiàn)出立體的三維感覺。

微分干涉圖片

DIC顯微鏡的物理原理完全不同于相差顯微鏡，技術設計要復雜得多。DIC利用的是偏振光，有四個特殊的光學組件：偏振器(polarizer)、 DIC棱鏡、DIC滑行器和檢偏器(analyzer)。偏振器直接裝在聚光系統(tǒng)的前面，使光線發(fā)生線性偏振。在聚光器中則安裝了偌瑪斯斯棱鏡，即DIC 棱鏡，此棱鏡可將一束光分解成偏振方向不同的兩束光(x和y)，二者成一小夾角。聚光器將兩束光調(diào)整成與顯微鏡光軸平行的方向。最初兩束光相位一致，在穿 過標本相鄰的區(qū)域后，由于標本的厚度和折射率不同，引起了兩束光發(fā)生了光程差。在物鏡的后焦面處安裝了第二個偌瑪斯斯棱鏡，即DIC滑行器，它把兩束光波 合并成一束。

蔡司顯微鏡這時兩束光的偏振面(x和y)仍然存在。最后光束穿過第二個偏振裝置，即檢偏器。在光束形成目鏡DIC影像之前，檢偏器與偏光器的方向成直角。檢偏 器將兩束垂直的光波組合成具有相同偏振面的兩束光，從而使二者發(fā)生干涉。x和y波的光程差決定著透光的多少。光程差值為0時，沒有光穿過檢偏器;光程差值 等于波長一半時，穿過的光達到最大值。于是在灰色的背景上，標本結構呈現(xiàn)出亮暗差。為了使影像的反差達到最佳狀態(tài)，可通過調(diào)節(jié)DIC滑行器的縱行微調(diào)來改 變光程差，光程差可改變影像的亮度。調(diào)節(jié)DIC滑行器可使標本的細微結構呈現(xiàn)出正或負的投影形象，通常是一側亮，而另一側暗，這便造成了標本的人為三維立 體感，類似大理石上的浮雕

工具顯微鏡的微分干涉原理圖

五.偏光顯微鏡(Polarizing microscope POL )

偏光顯微鏡的特點

偏光顯微鏡是鑒定物質(zhì)細微結構光學性質(zhì)的一種顯微鏡。凡具有雙折射的物質(zhì)，在偏光顯微鏡下就能分辨的清楚，當然這些物質(zhì)也可用染色發(fā)來進行觀察，但有些則不可能，而必須利用偏光顯微鏡。

偏光顯微鏡的特點，就是將普通改變?yōu)槠膺M行鏡檢的方法，以鑒別某一物質(zhì)是單折射(各向同行)或雙折射性(各向異性)。

雙折射性是晶體的基本特性。因此，偏光顯微鏡被廣泛地應用在礦物，化學等領域。在生物學和植物學也有應用。

六.浮雕相襯工具顯微鏡(RC HMC )

1975年，Robert Hoffman 博士發(fā)明

2002年，專利到期，各顯微鏡廠家紛紛推出采用以自己名義命名的RC技術產(chǎn)品

工具顯微鏡的原理

斜射光照射到標本產(chǎn)生折射、衍射，光線通過物鏡光密度梯度調(diào)節(jié)器產(chǎn)生不同陰影，從而使透明標本表面產(chǎn)生明暗差異，增加觀察對比度

特點

提高未染色標本的可見性和對比度;

圖象顯示陰影或近似三維結構而不會產(chǎn)生光暈;

可檢測雙折射物質(zhì)(巖石切片、水晶、骨頭) ;

可檢測玻璃,塑料等培養(yǎng)皿中的細胞,器官和組織;

聚光鏡的工作距離可以設計的更長;

RC物鏡也可用于明場,暗場和熒光觀察

七：熒光顯微鏡(Fluorescence Microscopy FL)

熒光鏡檢術是用短波長的光線照射用熒光素染色過的被檢物體，使之受激發(fā)后而產(chǎn)生長波長的熒光，然后觀察。

熒光圖象

工具顯微鏡的優(yōu)點：

檢出能力高(放大作用)

對細胞的刺激小(可以活體染色)

能進行多重染色

工具顯微鏡的用途：

物體構造的觀察——熒光素

 熒光的有無、色調(diào)比較進行物質(zhì)判別——抗體熒光等

 發(fā)熒光量的測定對物質(zhì)定性、定量分析